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Ricerca scientifica
Analisi enzimatica sul GCF in ipossia d’alta quota (Everest).
P.TRENTINI *, L.CIAVARELLI, E.SERRA , G. DI BLASIO e G.SPOTO (Cattedra di Materiali Dentari, Prof. G.Spoto Dipartimento di Scienze Odontostomatologiche, Università “G. D’Annunzio, Chieti, Italia)

Introduzione

L’ipossia può essere fisiologica o patologica. Definiamo ipossia d’ alta quota la riduzione della tensione parziale di ossigeno nell’ aria conseguente alla diminuzione della pressione barometrica. E’ fisiologica l’ipossia conseguente all' esposizione ad alte quote; quando tale condizione sconfina in patologia si parla di "High altitude illness".
La ridotta disponibilità di ossigeno ad alta quota crea delle variazioni nella composizione dell’ aria alveolare e di conseguenza nella composizione chimica del sangue. In queste condizioni l’organismo incomincia a soffrire della riduzione o mancanza di ossigeno in seno ai tessuti.
Recentemente è stata descritta tale malattia in concomitanza di una terapia canalare[1]. L' ipossia d’ alta quota influenza il sistema cardiovascolare, respiratorio ed elettrolitico (sodio, potassio, calcio e fosfato, creatinina, bilirubina, fosfatasi alcalina, aspartato aminotransferasi)[2]. Tali ricerche hanno evidenziato che esposizioni ad alta quota causano un incremento di osmolarità, sodio, creatinina, calcio, fosfato, bilirubina, inoltre provocano modificazioni ed un riequilibrio dell’intero meccanismo omeostatico.
Le reazioni respiratorie dell’organismo alla diminuzione della pressione parziale di ossigeno comprendono:
aumento del numero degli atti respiratori nell’ unità di tempo (frequenza respiratoria – tachipnea);
aumento della profondità respiratoria (polipnea).
Questi due meccanismi concorrono a determinare un incremento della ventilazione polmonare.
Le reazioni cardiocircolatorie dell’organismo alla riduzione della tensione dell’ossigeno sono:
aumento della gittata sistolica
aumento della frequenza cardiaca - tachicardia
aumento della pressione arteriosa - ipertensione
vaso-dilatazione
Si hanno variazioni anche nella parte corpuscolata del sangue. In quota si ha un incremento dei globuli rossi che a 7000-8000 metri possono raggiungere valori di 8 milioni e più per mm3 e cioè avere un incremento dell’ematocrito fino al 60%.
La % di emoglobina (Hb) raggiunge valori di 25-30.
A parità di quota, la variazione della pressione atmosferica è latitudine dipendente. I valori della pressione atmosferica sono più alte vicino all’equatore a causa della grande massa di aria fredda presente nella stratosfera di questa regione. La pressione a livello della vetta del Monte Everest varia considerevolmente con la stagione, essendo circa 11.5 Torr più alta nel pieno dell’estate che nel pieno dell’inverno [3].
solco crevicolare e gcf
Nell’ ambito del sistema parodontale, il solco crevicolare è quello spazio fisiologico delimitato dalla giunzione amelo-cementizia (porzione anatomica di passaggio dalla corona alla radice) dell’elemento dentario e dal cercine di gengiva libera circumferenziale al medesimo.
Il fluido crevicolare gengivale è un essudato del tessuto parodontale che si riversa nel solco gengivale attraversando l’epitelio sulculare. Esso, percorrendo i tessuti profondi, ne cattura i sottoprodotti del metabolismo locale.
E’ ampiamente dimostrato [4] che la variazione nel tipo e nella quantità di diversi componenti del GCF rispecchia lo stato metabolico, e quindi di salute o di malattia, del parodonto. Le molecole di cui si è accertata tale relazione oggi sono molteplici: GAG (glicosaminoglicano), PGE2 (prostaglandina E2), IL-1 e IL-6 (interleuchine proinfiammatorie), Osteocalcina, ALP (fosfatasi alcalina) enzima coinvolto nei processi di metabolismo osseo, AST (aspartato aminotransferasi), ACP (fosfatasi acida), TRAP (fosfatasi acida tartrato-resistente)…
Le fosfatasi catalizzano l'idrolisi degli esteri dell'acido fosforico[5]. E' stato osservato che esistono fosfatasi specifiche selettive solo per una determinata classe di substrati e fosfatasi non specifiche capaci di interagire con substrati diversi[6]. Queste differenti famiglie hanno distribuzione ubiquitaria all'interno dell'organismo e sono presenti sotto molteplici forme isoenzimatiche. Distinguiamo una fosfatasi alcalina da una acida, classificazione che varia a seconda del pH in cui si esplica la loro massima attività[7]. Oltre queste due fosfatasi, relativamente aspecifiche, esistono altre fosfatasi specifiche per determinati esteri fosforici (ad esempio la glucosio-6-fosfatasi, la fruttosio di-fosfatasi ecc..).
La fosfatasi alcalina (fosfoidrolasi di un monoestere fosforico) e' presente nelle sue forme isoenzimatiche in tutti i tessuti umani e animali ed è pure diffusa tra i microrganismi[8]. Le forme isoenzimatiche oggi note sono: ALP1 (epatica), ALP2 (epatica ed ossea), ALP3 (intestinale), ALP4 (biliare), ALP5 (renale), ALP6 (placentare) e ALP7 (carcinoplacentare).
La fosfatasi alcalina (ALP) è considerata essere un marker dell'infiammazione e di deposizione ossea[9].

MATERIALI E METODI
campionatura del gcf
Un solo operatore ha raccolto i dati clinici. La contaminazione dei campioni di GCF è stata minimizzata registrando la presenza di placca prima di essere cautamente rimossa, quindi campionando il GCF dall’area isolata[10]. Il GCF è stato raccolto mediante l’uso di coni di carta endodontici (Inline, Torino, Italy), inseriti 1 mm nel solco gengivale e lasciati in situ per 30 secondi. Particolare attenzione è stata prestata ad evitare ingiurie meccaniche nei siti sperimentali e i campioni contenenti sangue sono stati scartati. Immediatamente dopo la raccolta del GCF, i coni di carta sono stati trasferiti in vials di polietilene al fine di garantire un ambiente asettico e congelati a –20°C fino all'analisi biochimica[11].
determinazione dell’attività dell’alp
La metodica analitica utilizzata per l'analisi dell'attività dell'ALP e' stata di tipo cinetico. La reazione è stata monitorata previa lettura spettrofotometrica (spettrofotometro UV-Vis a fotodiodi Hewlett-Packard, modello 8453).

L'ALP catalizza la reazione di idrolisi del p-nitrofenilfosfato a p-nitrofenato e fosfato inorganico. Il quantitativo di incremento in assorbenza del p-nitrofenato, a 405 nm, è proporzionale all'attività dell'ALP del campione. Viene definita come 1 unità di attività dell’ALP la quantità di enzima che catalizza la formazione di 1 ?mol/L di p-nitrofenato per minuto a 30 °C[12].
Sono stati presi in considerazione alpinisti (caucasici) e nativi (sherpa tibetani) di età compresa tra i 25 e i 60 anni di sesso maschile e femminile.
Il fluido crevicolare gengivale è stato prelevato dai siti MV (mesio-vestibolare), DV (disto-vestibolare), MP (mesio-palatale ), DP (disto-palatale) dei denti 11 e 21 per la valutazione dell' attività dell'ALP. Tali siti devono essere esenti da patologia, e, ove manchi l' elemento considerato, si prende in esame quello più prossimo. In ogni sito di raccolta l'esame clinico è consistito nel registrare:
la presenza di placca sopragengivale (PL+);
la presenza di sanguinamento gengivale entro 15 secondi dopo il sondaggio (BOP+);
la profondità di sondaggio (PPD).

Ogni sito di raccolta del GFC incluso in questo studio è stato isolato con rulli di cotone inseriti a livello del fornice. Prima di raccogliere il GFC ogni residuo di placca sopragengivale, se presente, è stato rimosso tramite un batuffolo di cotone e un delicato getto d'aria veniva direzionato verso la superficie del dente per 5 secondi al fine di asciugare la zona.
Il GFC è stato raccolto usando dei coni di carta sterili di dimensioni standardizzate #30, inseriti per 1-2 mm nel solco gengivale e lasciati "in situ" per 30 secondi.
Dopo la raccolta i coni di carta sono stati immediatamente trasferiti all' interno di microtubi e conservati a -20ºC fino al momento dell' analisi.
I prelievi sono stati effettuati in condizioni di pre esposizione (1000 metri) e a quote elevate (5200 metri).
E’ doveroso sottolineare il fatto che il prelievo è stato effettuato in modo da risultare del tutto innocuo e non invasivo.
Monitoraggio di parametri fisiologici-ematochimici mediante l’utilizzo del sistema I – STAT (Abbott, U.S.A.), mediante l’uso di cartucce reattive, specifiche per la rilevazione e successiva quantificazione, in tempo reale, di elementi biologici presenti nel sangue. Il sistema I–STAT è progettato per la misurazione di campioni di sangue fresco intero, il sistema comprende un gruppo completo di componenti per l’esecuzione delle analisi. Il sistema è un analizzatore portatile a batteria capace di esaminare i parametri con 2 –3 gocce di sangue fresco intero, venoso e arterioso ed i risultati vengono elaborati in circa due minuti. Gli esami effettuati sono stati i seguenti: pH, sodio, potassio, calcio, glucosio, ematocrito, emoglobina, pCO2 (pressione parziale di anidride carbonica); pO2 (pressione parziale di ossigeno); TCO2 (anidride carbonica totale); HCO3 (bicarbonato); BE ecf (eccesso di base); sO2 (saturazione dell’ossigeno).

RISULTATI
La media dei valori di assorbanza rilevata sui campioni prelevati a livello del mare su 8 persone (T0), utilizzati come controllo, è stata di 0,17 ± 7,43 10-4 UA.
La media dei valori di assorbanza rilevata sui trenta (30) campioni prelevati a 1000 mt s.l.m. è stata di 0.3771 ± 0,0602 UA, mentre la media dei valori di assorbanza rilevata sui venti (20) campioni prelevati a 5200 mt s.l.m. è stata pari a 0.4074 ± 0,0524 UA (fig.1). L’ utilizzo dei test statistici di Fisher’s PLSD, Scheffe e Bonferroni /Dunn ha messo in evidenza la significatività tra i valori controllo e quelli prelevati a mille metri (p < 0,0001) e tra i valori controllo e quelli prelevati a 5200 m (p < 0,0001).
Per quanto riguarda le variazioni dei parametri ematochimici alle medesime quote, si osserva, in accordo alla bibliografia, modificazioni in senso adattativo. Dall’analisi dei risultati ottenuti e dall’interpretazione dei suddetti parametri fisiologici, è apparso palesemente evidente che il trend più significativo è quello dell’emoglobina e dell’ematocrito. Tale comportamento concorda con i concetti fondamentali dell’omeostasi e dell’acclimatazione. In altre parole possiamo dire che, mentre il pH e gli elettroliti vengono mantenuti entro i range fisiologici compatibili, l’incremento dell’emoglobina e dell’ematocrito (come precededentemente altri autori hanno descritto [3]) sono espressione dell’acclimatazione. L’incremento dell’emoglobina passa dai valori medi di 13,9 g/l (ds ± 0,69) al livello del mare fino a 17,4 g/l (ds ± 1,69) dei 5200 m, mentre l’ematocrito va dai normali valori 41,0 (ds ± 1,41) a 48,0 (ds ± 3,07) HCT%PCV dei 5200 m. I valori, analizzati con l’utilizzo dei test statistici di Fisher’s PLSD, Scheffe e Bonferroni /Dunn, ha evidenziato la significatività tra i valori controllo e quelli prelevati a 5200 m , per l’Hb (emoglobina) (p < 0,0003) e tra i valori controllo e quelli prelevati a 5200 m per Hct (l’ematocrito) (p < 0,0003).

Basale (0mt s.l.m.) n. 8
0,17
0,036
PE (1000mt) n. 30
0,3771
0,06
E (5200 mt) n.21
0,4074
0,05
Fig. e Tab.1: Attività dell’ALP a livello basale[13], pre-esposizione (PE) ed esposizione (E)
DISCUSSIONE
Dalle analisi effettuate si è visto che all’incrementare dell’altitudine si ha un aumento dell’attività della fosfatasi alcalina (Fig. 1). In accordo con i lavori descritti in letteratura[2] anche noi abbiamo osservato una significativa influenza dell’ ipossia da alta quota sul sistema cardiovascolare, respiratorio ed elettrolitico mediante l’utilizzo dell’apparecchio I-STAT, che permette di analizzare in tempo reale (2 minuti) i parametri fisiologici (Fig 2-3). Nell’ambito distrettuale (solco crevicolare), i dati ricavati dal nostro studio sulla variazione dell’ attività della fosfatasi alcalina (ALP) in condizioni di bassa tensione di ossigeno, hanno confermato questo andamento. Questi risultati possono essere paragonati a quelli ottenuti da Kubota[14] che ha studiato, durante i movimenti ortodontici in ipossia al 10%, i cambiamenti vascolari nei tessuti periodontali osservando un aumento della fosfatasi alcalina e di PGE2, dei fibroblasti del legamento parodontale e degli osteoblasti.
Fig. 2: Variazioni dell’emoglobina al variare dell’altitudine.

Fig. 3: Variazioni dell’ematocrito al variare dell’altitudine.

CONCLUSIONI

Dai risultati ottenuti si evince che lo stimolo ipossico, al quale è sottoposto l’intero organismo, determina un risentimento tissutale generalizzato. Nel solco crevicolare, da noi analizzato, la riduzione della pressione parziale di O2 porta ad una modificazione dei componenti del fluido crevicolare che determina un incremento dell’attività della Fosfatasi Alcalina (ALP) conseguente all’aumentare della quota (e quindi all’aumento dell’ipossia).
La risposta positiva dell’attività enzimatica di tipo ALP è di notevole rilevanza poichè è stato ampiamente dimostrato che la variazione nel tipo e nella quantità di diversi componenti del GCF rispecchia lo stato metabolico, e quindi di salute o di malattia, del parodonto.
Naturalmente è auspicabile che detto ambito di interesse venga perseguito per incrementare le conoscenze al fine di realizzare un sistema di ricerca odontoiatrico non invasivo, ben tollerato e ripetibile che possa monitorare lo stato di salute dell’elemento dentario e del suo sistema di supporto. L’assoluta novità della ricerca, con la ovvia mancanza di risultati in vivo da confrontare, ci impone di prenderli sic et sempliciter. Alla luce dei risultati ottenuti, si sta organizzando un nuovo progetto di ricerca (Aconcagua 2006) che intende fornire un maggior numero di campioni analizzabili a diverse altitudini.
BIBLIOGRAFIA
1.Finsterer J: “High-altitude illness induced by tooth root infection”, Postgrad Med J. 1999 Apr; 75 ( 882 ): 227-8.
2.Kametas N, Mc Auliffe F, Kramp E, Sherwood R, Nicolaides KH: Material electrolyte and liver functions changes during pregnancy at "High Altitude", Clin. Chem. Acta. 2003 Feb; 328 (1-2): 21-9
3.West JB, Lahiri S, Maret KH, Peters RM Jr, Pizzo CJ: Barometric pressures at extreme altitudes on Mt. Everest: physiological significance. J Appl Physiol. 1983 May,54(5):1188-94.
4.Chapple IL, Garner I, Saxby MS, Moscrop H, Matthews JB: “Prediction and diagnosis of attachment loss by enhanced chemiluminescent assay of crevicular fluid alkaline phosphatase levels” Oral Diseases Research Group, School of Dentistry, University of Birmingham, UK J Clin Periodontol. 1999 Mar;26(3):190-8..
5.Reginald H,. Garrett C., Grisham M.: “BIOCHIMICA” Zanichelli, Milano, 1998.
6.Laurence A, Moran K,Gray Scrimgeo H, Robert Horton Raymond S. Ochs J. David Rawn. “BIOCHIMICA”. 2a edizione. McGraw-Hill, Milano. 1996.
7.Moss DW: “Alkaline phosphatase isoenzymes” Clin Chem 1982;28:2007-16.
8.Magnusson P, Farley JR: “Differences in sialic acid residues among bone alkaline phosphatase isoforms: a physical, biochemical and immunological characterization” Calcif Tissue Int. 2002 Dec;71(6):508-18. Epub 2002 Sep 18.
9.Panteghini M, Pagani F: “Biological variation in bone-derived biochemical markers in serum” Scand J Clin Lab Invest 1995;55:609-16.
10.Bagga BSR, Murphy RA, Anderson AW: “Contamination of dental unit cooling water with oral microorganism and its prevention” JADA 109,712-716, 1984.
11.Crawford JJ: “Clical asepsis in dentisty” Dallas, Kolstad R A,1978.
12.Liu, M., Costa, C., Moura, I.: “Metothods in enzymology” 243, 303-319, 1994.
13.Perinetti G, Paolantonio M, Serra E, D’Archivio D, Piccolomini R, Festa F, Spoto G: “Longitudinal monitoring of subgingival colonization by Actinobacillus actinomicemcomitans, and crevicular alkaline phosphatase and spartate aminotransferase activities around orthodontically treated teeth” J.Clin.Periodontol 2004; 31:1-9
14.Kubota M: Study on proliferation and function of periodontal ligament fibroblasts and osteoblastic cells under hypoxia. Kokubyo Gakkai Zasshi. 1989 Dec;56(4):473-84
 
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